Метод Циля — Нильсена (Bymk; Enlx — Unl,vyug)

Изображение окрашенных клеток Mycobacterium tuberculosis

Метод окраски по Цилю — Нильсену (по Цилю — Нельсену) — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат карболовый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.

Метод назван именами немецких медиков — микробиолога Франца Циля и патологоанатома Фридриха Нельсена (Нильсена), которые разработали его в 1882—1883 гг.

Приготовление

Реактивы

• спирт этиловый 96- марки ОП-2, ТУ 6-09-4512-77;
• кислота соляная концентрированная, ГОСТ 3118-77;
• кислота серная концентрированная, ГОСТ 4204-77;
• фенол кристаллический (карболовая кислота), ГОСТ 6417-72;
• фуксин основной, ТУ 6-09-3804-82;
• метиленовый синий хлорид, ТУ 6-09-945-75;
• глицерин, ЧДА, ГОСТ 6259-75;
• вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Приготовление растворов

• Раствор 1. Насыщенный спиртовой раствор фуксина: растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2 — 3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96- этилового спирта.
• Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5 % водный раствор): расплавить 5 г кристаллического фенола путём лёгкого подогревания на водяной бане (температура плавления фенола 41 °C). Добавить слегка подогретую дистиллированную воду до объёма 100 мл.
• Раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина: в 90 мл полученного раствора фенола (2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (1).
• Раствор 4. Обесцвечивающие растворы:
  • Раствор серной кислоты. К 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая её по стенкам сосуда. Смешать. Содержимое нагреется. Никогда не добавляйте воду в кислоту!
  • Раствор солянокислого спирта. Вместо раствора серной кислоты для обесцвечивания можно использовать 3 % солянокислый спирт: Этиловый спирт 96 % — 97 мл, Концентрированная соляная кислота — 3 мл. К 97 мл спирта осторожно добавляют 3 мл концентрированной соляной кислоты. Всегда осторожно вливайте кислоту в спирт, но не наоборот.
• Раствор 5. Рабочий раствор метиленового синего:

растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Этапы окраски

• Фиксированный мазок, депарафинизированный срез, покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё карболовый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2—3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.
• Препарат обесцвечивают путём погружения или нанесения на него 25%-го раствора серной кислоты или 3 % солянокислого спирта в течение 30 секунд, и промывают несколько раз водой.

• Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 1 минуту, промывают водой и высушивают.

При окраске по этому методу кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет.

Техника микроскопического исследования препарата

Морфологические характеристики кислотоустойчивых микобактерий после окраски

Кислотоустойчивые микобактерии туберкулёза имеют в длину примерно 1 — 10 мкм, в ширину — 0,2 — 0,6 мкм. Обычно они видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. При окраске карболовым фуксином микобактерии туберкулёза выявляются в виде тонких, слегка изогнутых палочек малиново-красного цвета, содержащих различное количество гранул. Микроорганизмы, располагающиеся поодиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры «V».

Внутри отдельных микробных клеток могут обнаруживаться участки более интенсивного окрашивания, в результате чего они похожи на «бусы», а более слабо окрашенные участки могут быть видны в виде «полос». В препарате могут выявляться также изменённые коккоподобные кислотоустойчивые формы возбудителя, округлые сферические или мицелиеподобные структуры. Однако в случае обнаружения изменённых форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтверждён дополнительными методами исследования.

Некоторые другие микроорганизмы, не относящиеся к М.tuberculosis, могут иметь различные формы — от длинных палочек до кокковидных форм с различной интенсивностью окрашивания. Различную степень кислотоустойчивой окраски можно наблюдать не только у микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут быть Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora. Быстрорастущие микобактерии могут отличаться по степени кислотоустойчивой окраски — при частичной потере кислотоустойчивой окраски они приобретают фиолетово-малиновый цвет.

При культуральном исследовании ответ о выделении кислотоустойчивых микобактерий даётся только после микроскопии окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из выросших колоний. При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулёза проявляют свои физико-химические особенности: они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию. Это обусловлено наличием в составе их клеточной стенки большого количества гидрофобных жировосковых субстанций. При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Циль-Нельсену, обнаруживаются яркие малиново-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами, образующие скопления или переплетения в виде «войлока» или «кос». Микобактерии туберкулёза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1 — 10 (чаще 1 — 4) мкм, шириной 0,2 — 0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закруглёнными концами. Чаще в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно окрашенных зёрен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулёзными препаратами, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм.

Порядок проведения микроскопического исследования

При микроскопическом исследовании мазка следует просматривать не менее 100 полей зрения, чтобы дать количественную оценку препарату и обнаружить единичные микобактерии. В том случае, если результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения просматривают дополнительно 200 полей зрения. При значительном количестве кислотоустойчивых микобактерий достаточно исследовать 20 — 50 полей зрения как при окраске по Циль-Нильсену, так и при люминесцентной микроскопии (см. таблицу). При микроскопическом исследовании препарата необходимо быть уверенным, что ни одно поле зрения препарата не просматривается повторно, поэтому рекомендуется просматривать препарат всегда по одной и той же схеме:

• либо 3 параллельных прохода по длине препарата;
• либо 9 параллельных проходов по ширине.

Просматривать препарат начинают с левого верхнего выбранного в мазке поля зрения, постепенно передвигаясь либо вдоль продольной оси препарата до конца мазка, либо смещаясь вниз и затем вновь поднимаясь вверх и т. д., проходя все поля зрения до границы мазка. При увеличении микроскопа 1000x, то есть 100x для масляно-иммерсионного объектива и 10x для окуляра, при исследовании одной длины мазка (~ 20 мм) за один продольный проход просматривается около 100—120 полей зрения (диаметр поля зрения — 0,16 — 0,2 мм).

Градация результатов микроскопического исследования

Результат исследования	Минимальное число полей зрения(п/з)	Форма записи результата	Интерпретация результатов исследования
КУМ не обнаружены в 300 п/з	300	ОТР.	Отрицательный
1 — 2 КУМ в 300 п/з	300	Рекомендуется повторить исследование	Результат не оценивается
1 — 9 КУМ в 100 п/з	100	«_N__» КУМ в 100 п/з	Положительный
10 — 99 КУМ в 100 п/з	100	1+	Положительный
1 — 10 КУМ в 1 п/з	50	2+	Положительный
Более 10 КУМ в 1 п/з	20	3+	Положительный